1適用范圍(氣相色譜法測(cè)定氯酶素殘留含量)
本方法用于測(cè)定肉牛的肌肉組織中氯霉素的殘留量。
2 原理
組織經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶消化，經(jīng)乙酸乙酯提取，然后將乙酸乙酯濃縮。加4％氯化鈉溶液，剩余的乙酸乙酯用氮?dú)獯蹈?。將鹽溶液過(guò)C18萃取小柱，用20％甲醇洗滌，用甲醇洗脫。將洗脫液蒸發(fā)至干并固化，用配有電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜儀測(cè)定氯霉素。異氯霉素做內(nèi)標(biāo)物定量。
3可靠的檢測(cè)限
本方法在牛肌肉組織的檢測(cè)限為1.0ng/g。
4儀器
4.1氣相色譜儀，配電子捕獲檢測(cè)器（63Ni）。
4.2電子天平：感量0.00001g。
4.3勻漿機(jī)。
4.4離心機(jī)。
4.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
4.6振蕩器。
4.7電熱恒溫水浴鍋。
4.8固相萃取柱：C18柱。
5藥品與試劑
5.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。
5.2異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)標(biāo)物。
5.3β-葡萄糖醛酸酶－IX：生化試劑。
5.4甲醇：分析純。
5.5乙酸乙酯：分析純。
5.6正已烷：分析純。
5.7三氯甲烷：分析純。
5.8乙腈：色譜純。
5.9環(huán)已烷：分析純。
5.10氯化鈉：分析純。
6溶液
6.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存。臨用前，取此儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
6.2異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取異氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存。臨用前，取此儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成濃度為100μg/mL的內(nèi)標(biāo)液。
6.30.1mol/L?KH2PO4和Na2HPO4的緩沖液（pH6.8±0.1)：用相應(yīng)的干試劑調(diào)節(jié)pH為6.8。
6.4β-葡萄糖醛酸酶－IX：用緩沖液稀釋至4000單位／mL。
6.5Sylon?HTP溶液：六甲基二硅烷（HMDS）3份，氯化**基硅烷1份，吡啶9份。
7 分析
7.1提取和純化
7.1.1將組織解凍，稱取肌肉組織10g（**到0.1g），置于50mL玻璃離心管中。向每個(gè)樣品中加100μL異氯霉素內(nèi)標(biāo)液（100μg/mL）。
7.1.2每個(gè)分析樣品配制1個(gè)空白、3個(gè)添加樣品。向空白組織中加內(nèi)標(biāo)。回收率樣品中加工作液，制成0.5mL/L（50μL工作液），1.0mL/L(100μL工作液），2.0mL/L(200μL工作液）的樣品。由添加樣品得到的數(shù)據(jù)用于計(jì)算。
7.1.3向所有空白、添加對(duì)照和樣品管中加15mL磷酸鹽緩沖液（pH6.8±0.1)和200μL－β-葡萄糖醛酸酶（800單位），在室溫條件下混合30s-60s。
7.1.4將所有管置于37℃保溫90min。保溫后，樣品可以放在冰箱中過(guò)夜。
7.1.5樣品放回室溫平衡。向各管加乙酸乙酯15mL，旋渦混合30s提取氯霉素。
7.1.62000r/min的速度離心2min。
7.1.7用一次性滴管吸取乙酸乙酯液（上層）留用并轉(zhuǎn)移到另一干凈的50mL離心管中。
7.1.8重復(fù)（步驟D.7.1.5-D.7.1.7)提取樣品，并合并提取液。
7.1.9在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60℃的沙浴去除乙酸乙酯使體積約為1mL。
7.1.10向各管加4％氯化鈉溶液4mL，混合5s-10s。
7.1.11繼續(xù)蒸發(fā)去除乙酸乙酯至乙酸乙酯層干，剩下小量的油性殘留物。
7.1.12向4％氯化鈉溶液層加正已烷4mL，混合10s。2000r/min的速度離心1min，棄掉上層。
7.1.13重復(fù)步驟D.7.1.12。
注意：以下步驟D.7.1.14至步驟D.7.1.17必須立即連續(xù)做完。切莫讓吸附劑變干。
7.1.14給每個(gè)樣品、空白和添加對(duì)照準(zhǔn)備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇和10mL水洗滌C18柱。棄掉洗滌液。
7.1.15用一次性巴氏吸管吸取全部水相溶液裝入C18柱過(guò)柱，棄掉流出液。
7.1.16用1mL水混合淋洗樣品管2遍，并將淋洗液加入C18柱過(guò)柱，棄掉流出液。
7.1.17用1mL水，然后2mL甲醇－水（2＋8）洗滌C18柱。讓*后一次洗滌液完全流出C18柱。棄掉洗液。
7.1.18用乙腈將C18柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1.5mL，合并洗脫液到一干凈的10mL培養(yǎng)管中。
7.1.19在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60℃的沙浴蒸發(fā)去除乙腈至約為0.5mL。
7.1.20轉(zhuǎn)移至1mL錐形瓶中。用0.5mL乙腈洗滌10mL培養(yǎng)管，旋渦混合5s，并將洗滌液加到1mL錐形瓶中。在60℃用氮?dú)饬鞔蹈伞?br /> 注意：從這兒開(kāi)始要防潮。
7.1.2向干的殘留物中加200μL??Sylon?HTP。
7.1.22蓋塞并旋渦混合5s。在60℃－70℃沙浴中反應(yīng)15min。
7.1.23在60℃用氮?dú)饬鞔蹈扇コ嘤嗟脑噭┱舭l(fā)至10μL。
注意：此步過(guò)長(zhǎng)的吹干時(shí)間可導(dǎo)致丟失分析物。
7.1.24將殘留物重新溶于100μL環(huán)已烷－正已烷（6＋4）中，旋渦混合5s。
7.1.25注入適量微升體積的衍生物到氣相色譜儀作定量測(cè)定。
7.2測(cè)定條件
7.2.1色譜柱：DB－1，30m×0.254mm?i.d.。
7.2.2載氣：氦氣，線性速度29cm/s。
7.2.3初始柱溫：80℃，維持1min。
7.2.4溫度程序：設(shè)定30℃／min升至260℃，維持10min或直到對(duì)位異構(gòu)體和氯霉素已經(jīng)流出。然后設(shè)定30℃／min升至300℃，維持5min以確保所有的樣品已經(jīng)流出。
7.2.5進(jìn)樣室溫度：280℃。
7.2.6檢測(cè)器溫度350℃。
7.2.7預(yù)期保留時(shí)間：氯霉素10min-11min，異氯霉素9.5min-10.5min。
7.2.8預(yù)期響應(yīng)值：對(duì)0.2ng氯霉素可以達(dá)到50％全刻度。
7.2.9進(jìn)樣量：適量。
7.3樣品測(cè)定
分別注入適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及適當(dāng)濃度的樣品溶液于氣相色譜儀中，按上述色條件進(jìn)行色譜分析。響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。
7.4計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（D.1)計(jì)算試樣中氯霉素殘留量：
W＝H·CS／HS·C………………………………（D.1)
式中：
W－試樣中氯霉素殘留量，單位為微克每克（μg/g)；
H－試樣液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm)；
Hs－標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm)；
CS-標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL)；
C－*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g/mL)。
注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
本方法用于測(cè)定肉牛的肌肉組織中氯霉素的殘留量。
2 原理
組織經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶消化，經(jīng)乙酸乙酯提取，然后將乙酸乙酯濃縮。加4％氯化鈉溶液，剩余的乙酸乙酯用氮?dú)獯蹈?。將鹽溶液過(guò)C18萃取小柱，用20％甲醇洗滌，用甲醇洗脫。將洗脫液蒸發(fā)至干并固化，用配有電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜儀測(cè)定氯霉素。異氯霉素做內(nèi)標(biāo)物定量。
3可靠的檢測(cè)限
本方法在牛肌肉組織的檢測(cè)限為1.0ng/g。
4儀器
4.1氣相色譜儀，配電子捕獲檢測(cè)器（63Ni）。
4.2電子天平：感量0.00001g。
4.3勻漿機(jī)。
4.4離心機(jī)。
4.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
4.6振蕩器。
4.7電熱恒溫水浴鍋。
4.8固相萃取柱：C18柱。
5藥品與試劑
5.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。
5.2異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)標(biāo)物。
5.3β-葡萄糖醛酸酶－IX：生化試劑。
5.4甲醇：分析純。
5.5乙酸乙酯：分析純。
5.6正已烷：分析純。
5.7三氯甲烷：分析純。
5.8乙腈：色譜純。
5.9環(huán)已烷：分析純。
5.10氯化鈉：分析純。
6溶液
6.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存。臨用前，取此儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
6.2異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取異氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中保存。臨用前，取此儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成濃度為100μg/mL的內(nèi)標(biāo)液。
6.30.1mol/L?KH2PO4和Na2HPO4的緩沖液（pH6.8±0.1)：用相應(yīng)的干試劑調(diào)節(jié)pH為6.8。
6.4β-葡萄糖醛酸酶－IX：用緩沖液稀釋至4000單位／mL。
6.5Sylon?HTP溶液：六甲基二硅烷（HMDS）3份，氯化**基硅烷1份，吡啶9份。
7 分析
7.1提取和純化
7.1.1將組織解凍，稱取肌肉組織10g（**到0.1g），置于50mL玻璃離心管中。向每個(gè)樣品中加100μL異氯霉素內(nèi)標(biāo)液（100μg/mL）。
7.1.2每個(gè)分析樣品配制1個(gè)空白、3個(gè)添加樣品。向空白組織中加內(nèi)標(biāo)。回收率樣品中加工作液，制成0.5mL/L（50μL工作液），1.0mL/L(100μL工作液），2.0mL/L(200μL工作液）的樣品。由添加樣品得到的數(shù)據(jù)用于計(jì)算。
7.1.3向所有空白、添加對(duì)照和樣品管中加15mL磷酸鹽緩沖液（pH6.8±0.1)和200μL－β-葡萄糖醛酸酶（800單位），在室溫條件下混合30s-60s。
7.1.4將所有管置于37℃保溫90min。保溫后，樣品可以放在冰箱中過(guò)夜。
7.1.5樣品放回室溫平衡。向各管加乙酸乙酯15mL，旋渦混合30s提取氯霉素。
7.1.62000r/min的速度離心2min。
7.1.7用一次性滴管吸取乙酸乙酯液（上層）留用并轉(zhuǎn)移到另一干凈的50mL離心管中。
7.1.8重復(fù)（步驟D.7.1.5-D.7.1.7)提取樣品，并合并提取液。
7.1.9在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60℃的沙浴去除乙酸乙酯使體積約為1mL。
7.1.10向各管加4％氯化鈉溶液4mL，混合5s-10s。
7.1.11繼續(xù)蒸發(fā)去除乙酸乙酯至乙酸乙酯層干，剩下小量的油性殘留物。
7.1.12向4％氯化鈉溶液層加正已烷4mL，混合10s。2000r/min的速度離心1min，棄掉上層。
7.1.13重復(fù)步驟D.7.1.12。
注意：以下步驟D.7.1.14至步驟D.7.1.17必須立即連續(xù)做完。切莫讓吸附劑變干。
7.1.14給每個(gè)樣品、空白和添加對(duì)照準(zhǔn)備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇和10mL水洗滌C18柱。棄掉洗滌液。
7.1.15用一次性巴氏吸管吸取全部水相溶液裝入C18柱過(guò)柱，棄掉流出液。
7.1.16用1mL水混合淋洗樣品管2遍，并將淋洗液加入C18柱過(guò)柱，棄掉流出液。
7.1.17用1mL水，然后2mL甲醇－水（2＋8）洗滌C18柱。讓*后一次洗滌液完全流出C18柱。棄掉洗液。
7.1.18用乙腈將C18柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1.5mL，合并洗脫液到一干凈的10mL培養(yǎng)管中。
7.1.19在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60℃的沙浴蒸發(fā)去除乙腈至約為0.5mL。
7.1.20轉(zhuǎn)移至1mL錐形瓶中。用0.5mL乙腈洗滌10mL培養(yǎng)管，旋渦混合5s，并將洗滌液加到1mL錐形瓶中。在60℃用氮?dú)饬鞔蹈伞?br /> 注意：從這兒開(kāi)始要防潮。
7.1.2向干的殘留物中加200μL??Sylon?HTP。
7.1.22蓋塞并旋渦混合5s。在60℃－70℃沙浴中反應(yīng)15min。
7.1.23在60℃用氮?dú)饬鞔蹈扇コ嘤嗟脑噭┱舭l(fā)至10μL。
注意：此步過(guò)長(zhǎng)的吹干時(shí)間可導(dǎo)致丟失分析物。
7.1.24將殘留物重新溶于100μL環(huán)已烷－正已烷（6＋4）中，旋渦混合5s。
7.1.25注入適量微升體積的衍生物到氣相色譜儀作定量測(cè)定。
7.2測(cè)定條件
7.2.1色譜柱：DB－1，30m×0.254mm?i.d.。
7.2.2載氣：氦氣，線性速度29cm/s。
7.2.3初始柱溫：80℃，維持1min。
7.2.4溫度程序：設(shè)定30℃／min升至260℃，維持10min或直到對(duì)位異構(gòu)體和氯霉素已經(jīng)流出。然后設(shè)定30℃／min升至300℃，維持5min以確保所有的樣品已經(jīng)流出。
7.2.5進(jìn)樣室溫度：280℃。
7.2.6檢測(cè)器溫度350℃。
7.2.7預(yù)期保留時(shí)間：氯霉素10min-11min，異氯霉素9.5min-10.5min。
7.2.8預(yù)期響應(yīng)值：對(duì)0.2ng氯霉素可以達(dá)到50％全刻度。
7.2.9進(jìn)樣量：適量。
7.3樣品測(cè)定
分別注入適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及適當(dāng)濃度的樣品溶液于氣相色譜儀中，按上述色條件進(jìn)行色譜分析。響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。
7.4計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（D.1)計(jì)算試樣中氯霉素殘留量：
W＝H·CS／HS·C………………………………（D.1)
式中：
W－試樣中氯霉素殘留量，單位為微克每克（μg/g)；
H－試樣液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm)；
Hs－標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm)；
CS-標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL)；
C－*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g/mL)。
注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
