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ELISA實(shí)驗(yàn)制備抗體酶結(jié)合物的方法

酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物(conjugate)??乖捎诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同,可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原,則可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

1、戊二醛交聯(lián)法:戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑,酶和抗體中的氨基可通過(guò)該試劑進(jìn)行偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法(如連接 AP),也可用二步法(如連接 HRP)。偶聯(lián)方法為:2~5 mg 純抗體與 5 mg AP 混合于1ml  0.1mol/L pH6.8 的磷酸鹽緩沖液中,并用此磷酸鹽緩沖液對(duì)該酶和抗體混合液于4℃ 下透析平衡。磁力攪拌下,向酶和抗體溶液中緩慢加入1%戊二醛0.05 ml,在室溫下放置2小時(shí)。在 4℃下使用 50mM pH8.0 Tris緩沖液對(duì)偶聯(lián)后的酶和抗體溶液透析平衡,即得酶標(biāo)抗體。

辣根過(guò)氧化物酶可溶解于50%飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50%飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體,棄去上清中游離酶。戊二醛一步法操作簡(jiǎn)便、有效,而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格,大小也不一,影響效果。制備 HRP 抗體結(jié)合物也可用二步法,即先將 HRP 與戊二醛作用,透析除去戊二醛,在 pH9.5 緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法 10 倍左右。

2、過(guò)碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含 18% 碳水化合物,過(guò)碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉(NaBH4)中和多余的過(guò)碘酸。酶上的醛根很活潑,可與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈,各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。

按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響 ELISA 中后的酶活性測(cè)定,因經(jīng)過(guò)洗滌,非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原,因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量,因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化,盡可能多的去除未偶聯(lián)酶的游離抗體。