操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產品特點：
1、公司產品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產品名稱
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赤點石斑魚神經壞死病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98883
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產品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細胞預處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細胞預處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現沉淀漂浮是正常現象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產品：
組織糖原磷酸化酶b（GLYCOGEN PHOSPHORYLASE）活性10次γ-亞麻酸甲酯
酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒苦地丁
細胞磷酸二酯酶（50042.1）總活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒20次爵床
組織磷酸二酯酶（PDE）總活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒20次薏苡仁
血液磷酸二酯酶（PDE）總活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒20次秦皮
細胞磷酸二酯酶（PDE）總活性熒光定量檢測試劑盒20次野牡丹
組織磷酸二酯酶（PDE）總活性熒光定量檢測試劑盒20次6-巰基嘌呤
血液磷酸二酯酶（PDE）總活性熒光定量檢測試劑盒20次水楊酸鎂
細胞磷酸二酯酶1（PDE1）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒10次鹽酸維拉帕米
組織磷酸二酯酶1（PDE1）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒10次呋咱甲氫龍（夫拉扎勃）
血液磷酸二酯酶1（PDE1）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒10次己酮可可堿
細胞磷酸二酯酶1（PDE1）活性熒光定量檢測試劑盒10次鹽酸洛美利嗪
組織磷酸二酯酶1（PDE1）活性熒光定量檢測試劑盒10次硝呋太爾雜質B
血液磷酸二酯酶1（PDE1）活性熒光定量檢測試劑盒10次丙戊酸鎂
細胞磷酸二酯酶2（PDE2）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒10次粉萆薢探針法PCR鑒定試劑盒
赤點石斑魚神經壞死病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒TGF-beta 2 轉移生長因子β2抗體二氟溴乙酸乙酯 97%
TGF beta 3 轉移生長因子β3抗體氫加蘭他敏 98%
TGF Beta R1/TGFBR1 轉移生長因子β受體1抗體二氫黃酮甙 97%
TGF beta R2/TGFBR2 轉移生長因子β受體2抗體半胱鹽酸鹽 98%
TGF Beta R3 轉移生長因子β受體3抗體鹽酸二氟沙星 分析標準品
TGM3 轉谷氨酰酶3抗體Α-D-五苯甲酸酰吡喃葡萄糖 98%
Thioster-containing protein 1 按蚊硫酯包含蛋白-1抗體4-甲基-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷 99%
ERdj5 ERdj5蛋白抗體對基-β-D-吡喃半乳糖苷 99%
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