目前,針對分子生物學(xué)實驗有多種技術(shù)方法,那么我們該如何判斷選擇哪種方法適合呢?我們需要去了解實驗方法的特性。無非就是用某種特定的刺激物(如細胞活素)去刺激一些細胞或組織,讓它們high起來,然后分析細胞對這些外源刺激物的反應(yīng),檢測細胞內(nèi)哪條信號通路被激活或失活,或者什么蛋白被分泌出來。每一種實驗方法都有它的特性,下面就以下幾種方法做介紹:
1、酶聯(lián)免 疫吸附劑測定(ELISA):
酶聯(lián)免 疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)如果要看看細胞外如何,比如細胞培養(yǎng)上清液或體液中的某種蛋白質(zhì)分泌情況,則通常選用ELISA,從而獲知相應(yīng)基因的活性。
2、表面等離子體共振(SPR):
表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)除了研究蛋白-蛋白相互作用(例如受體-配體相互作用),還有可研究小分子-蛋白或細胞-蛋白的相互作用。這種方法不需要標記蛋白(熒光標記或同位素標記),還可以實時定量分析這些相互作用的親和力、熱力學(xué)、動力學(xué)特性。SPR是分析動力學(xué)和親和力的金標準。
3、電泳遷移率實驗(EMSA):
電泳遷移率實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)初用于檢測DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合的情況,可做定性和定量分析,包括細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB )的活性等等,現(xiàn)在也常用于研究RNA結(jié)合蛋白和相應(yīng)的RNA序列相互作用。
這些分析用酶聯(lián)免 疫吸附實驗(Eenzymelinked ImmunosorbentAssay,ELISA)也可以做,原理差不多。
4、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR):
PCR(Polymerase Chain Reaction)或Real Time PCR可以把特定的DNA序列大幅擴增,便于檢測活性基因的表達情況。而且PCR用途很廣。
5、免 疫印跡實驗(WB):
免 疫印跡實驗(Western Blot,WB)可檢測信號通路中某種蛋白質(zhì)的特性、表達和分布,分析容量大、敏感度高、特異性強。建立蛋白質(zhì)的個人檔案。
但至于蛋白-蛋白相互作用則要用另一種復(fù)雜的方法,即免 疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation,Co-IP),它接近細胞內(nèi)的生理情況,是以成為經(jīng)典方法。