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PCR反應要素優(yōu)化配置

PCR反應要素優(yōu)化配置

1、引物及濃度:
①長度:15~30bp。
②堿基:G+C含量以40%~60%為宜,ATGC 好隨機分布,避免5個以上的堿基成串排列。③避免引物內部出現(xiàn)二級結構、兩條引物間互補,特別是3′端的互補。
④引物3′端的堿基,特別是末及倒數第2個堿基,應嚴格要求配對。
⑤與其它序列無明顯同源性。⑥濃度為0.1~1μmol或10~100pmol。

 
2、酶及其濃度:
催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100μl時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。
 
3、dNTP的質量與濃度
dNTP應為50~200μmol/L,4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),過高dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。
 
4、模板:
模板的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一,避免DNA純化中的SDS和蛋白酶K等雜質。
 
5、Mg2+濃度:
一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200μmol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。
 
6、溫度與時間:

①變性:93℃~94lmin℃,過高或過低的溫度影響酶的活性。②退火:取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。一般高于Tm值5℃~10℃,時間為30~60s。③延伸:常用溫度為72℃,時間根據待擴增片段的長度而定。

7、循環(huán)次數:主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數選在30~40次,循環(huán)次數越多,非特異性產物的量亦隨之增多。