?PCR引物設(shè)計(jì)基本原則

• 引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
• 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
• 引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進(jìn)一步放寬；
• 擴(kuò)增子Tm：>92℃；
• 3'端：優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG；
• 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；
• 末端2bp*好為GC；
• 引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
• 其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點(diǎn)互補(bǔ)，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補(bǔ)，盡量避免內(nèi)部回文。

基于上述原則，應(yīng)用分兩種情況：

(1) 基因克隆PCR引物設(shè)計(jì)

這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結(jié)束，什么GC%、二聚體和錯(cuò)配，可能根本由不得我們。既然起點(diǎn)定了，那只能通過改變長度來匹配*優(yōu)設(shè)計(jì)要求了。

(2) 鑒定PCR引物設(shè)計(jì)

我們只需要確認(rèn)一段DNA序列上的一部分，起點(diǎn)是相對的，我們可以在整個(gè)序列范圍內(nèi)搜索，引物設(shè)計(jì)的靈活性大大提高，當(dāng)然搜索時(shí)間也要增加。