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DEAE-纖維素,提取法純化,多克隆抗體
該法提取IgG簡(jiǎn)便,既可小量提取,也可大量制備。
1.批量提取法 稱取DEAE-纖維素(DE32或DE52)50g,置于1000ml燒杯中,先以蒸餾水漂浮除去細(xì)顆粒,再經(jīng)酸堿處理后,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽干,或用布氏濾斗(內(nèi)放兩層濾紙)過濾,收集濕纖維素,以降低其離子強(qiáng)度。按1ml血清加濕重5g DEAE纖維素,經(jīng)過充分?jǐn)嚢?,?℃吸附1h。上清液可再如此處理一次,即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡(jiǎn)便,既可小量提取,也可大量制備。
2.Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)
【材料和試劑】
(1)DE32或DE52纖維素。
(2)HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。
(3)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,**血清或飽和硫酸銨粗提品。
(4)1.5×50cm 層析柱;透析袋;紫外分光光度計(jì)及其他透析和層析所需的試劑和器材。
【操作步驟】
(1)DE52纖維素的處理:DE52經(jīng)酸、堿處理,0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡。
(2)裝柱:將層析柱固定于滴定架上,柱底墊一圓形尼龍紗,出口接一細(xì)塑料管并關(guān)閉出水。將浸泡于0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沉降3~5cm高時(shí),吸除0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl,或松開出水口螺旋夾,控制流速1~2ml/min,同時(shí)連續(xù)加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后,柱面放一圓形濾紙片。
(3)平衡:松開出水口螺旋夾,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡,控制流速為15滴/min,待流出液與洗脫液之pH值達(dá)到一致時(shí),停止平衡。
(4)待提取樣品的準(zhǔn)備:將蛋白裝入透析袋里,置4℃冰箱,對(duì)0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析過夜。
(5)加樣、洗脫與收集:用吸管吸去柱面液體,以毛細(xì)吸管沿柱壁加入樣品,樣品體積相當(dāng)于柱床體積的1%~2%,蛋白濃度為50~70mg。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進(jìn)入柱床內(nèi),并用少量洗脫液清洗柱壁;待液體進(jìn)入柱床后,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl洗脫,控制流速為14~16滴/min。分部收集器收集,紫外監(jiān)測(cè),或人工收集,以紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管280nm OD值,描繪洗脫液峰。
(6)濃縮:將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合并,裝入透析袋,以PEG濃縮至所需體積。
3.Tris-PO4離子交換層析法
該法在上述方法的基礎(chǔ)上稍加改良,即通過梯度洗脫,可用于血清中IgG和IgM的提取。
【材料和試劑】
(1)DE32或DE52纖維素。
(2)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,**血清或飽和硫酸銨粗提品。
(3)1.5×50cm 層析柱;透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
(4)梯度洗脫液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4;0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4;.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4。
【操作步驟】
(1)蛋白標(biāo)本對(duì)0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4透析。
(2)DE52裝柱,并以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4平衡。
(3)加樣,以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4洗脫,紫外監(jiān)測(cè)直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。
(4)以350ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4洗脫,這一步驟可用于純化血清IgG和IgM。
(5)以125ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4梯度洗脫,總量收集250ml;重復(fù)步驟(5)。
(6)根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰,透析濃縮和保存同上。
用過的DE52可用0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性,加入0.02%疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
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