甲型H1N1流感病毒（2009）試劑盒熒光PCR法

產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號強(qiáng)

儲(chǔ)存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
滑膜細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)維生素C鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測定 ascorbate

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs) 人肝癌細(xì)胞，Hep G2細(xì)胞 C127(細(xì)胞)硝酸硫胺（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測定Thiamine nitrate

人癌細(xì)胞;MDA-MB-157α-細(xì)辛腦,細(xì)辛(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥99%,標(biāo)準(zhǔn)品alpha-Asarone

BMPR1A Others Mouse 小鼠 ALK-3 / BMPR1A 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 鹽酸二氧丙嗪（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：鑒別Dioxopromethazine

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(亞系克隆);CHO-HCV-E1特比萘芬-d7鹽酸鹽質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Terbinafine-d7
143TK細(xì)胞，人胸腺激酶缺陷性細(xì)胞系 鼠傷寒沙門氏菌Ta100 大鼠腎小球系膜細(xì)胞;HBZY-13,5-二-L-酪氨酸3,5-Diiodo-L-tyrosine質(zhì)量規(guī)格：BR，98%

CX3CL1 Protein Canine 重組狗 Fractalkine / CX3CL1 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽L-Proline methyl ester 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR

MG-63(人骨肉瘤細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠 CD320 / 8D6A 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) L-絲氨酸甲酯鹽酸鹽L-Serine methyl ester 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

犬胸腺細(xì)胞;cf2ThL-色氨酸甲酯鹽酸鹽L-Tryptophan methyl ester 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

人前列腺平滑肌細(xì)胞(HPSMC)(5×105)L-酪氨酸甲酯L-Tyrosine methyl ester 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR
CSC, 小鼠心肌細(xì)胞TBE,5XLIQUIDCONCENTRATE5X TBE 濃縮液超級5LRT

人胚腎細(xì)胞;293FT 人腎動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mLR-Alpine-硼完 B-ISOPINOCcMPHqYL-9-BORcBICYCLO[3.3.1]NONcNq 7364-47-

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Aluminumphosphate三堿式嶙酸鋁100毫克AR，98.5%

KLK6 Others Human 人 KLK6 / Kallikrein 6 / Neurosin 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) GELLOADINGBUFFER,4X(BPB)DNA電泳上樣緩沖液,4X生物技術(shù)級5MLRT

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL(油紅O(5B))
大額牛與婆羅門牛雜交F1代皮膚成纖維樣細(xì)胞;BOS-6VAZO88偶氮二環(huán)己基甲500毫克AR

CDK1 Others Mouse 小鼠 CDC2 Kinase / CDK1 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 十六醇 1-Hqxcdqccnol 36623-8-4

食管上皮細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)PUC18shēng huà shì jì容量：RT1克

草魚腎細(xì)胞;GIK 人肝癌細(xì)胞，PLC/PRF/5細(xì)胞 NIH:OVCAR-3(卵巢癌細(xì)胞)TBP嶙酸正丁酯500克AR，99%

人腦瘤細(xì)胞;SF763352-11-44-扶錄芐alpha-Chloro-p-fluorotolue
檢測步驟：
甲型H1N1流感病毒（2009）試劑盒熒光PCR法一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

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