流感病毒N5亞型試劑盒熒光PCR法

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)

儲(chǔ)存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNAHCMEC NA1,3-雙(氯甲基)四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(GC)1,3-Bis(chloromethyl)tetramethyldisilazane

ZR75-30細(xì)胞，人癌細(xì)胞 129小鼠ES細(xì)胞,E14細(xì)胞 HNE2, 人鼻咽癌細(xì)胞系1,3-二苯基四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(GC)Tetramethyl-1,3-diphenyldisilazane

MX-1(人癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2N-亞硝基-N-甲基尿烷(>95.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格：>95.0%(GC)N-Methyl-N-nitrosourethane

HDMEC Pellet 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊(少年者) > 1 mio.cells 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基FM-prfMUG;4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR4-MUG

CL-0373KiMA(人胚腎上皮細(xì)胞系)5×106cells/瓶×2米諾地爾質(zhì)量規(guī)格：>98%Minoxidil
3T3-L1, 小鼠前脂肪細(xì)胞 MouseD-氨基葡萄糖鹽酸鹽D-Glucosamine 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR

TNFRSF10A Others Human 人 TNFRSF10A / CD261 / APO2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 奧卡西平Oxcarbazepine質(zhì)量規(guī)格：≥99.0%,BR

人肝癌細(xì)胞;SMMC-7721奧卡西平（標(biāo)準(zhǔn)品）Oxcarbazepine質(zhì)量規(guī)格：HPLC>99%,標(biāo)準(zhǔn)品

3. 毛發(fā)細(xì)胞系統(tǒng)金絲桃素(標(biāo)準(zhǔn)品)Hypericin質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標(biāo)準(zhǔn)品

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞D-葡萄糖-6-1酸D-（+）-Glucopyranose 6-phosphate質(zhì)量規(guī)格：1M in H2O(260Mg/ml),進(jìn)口原裝
NIH:OVCAR-3細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞,KYSR450細(xì)胞 豚鼠皮膚細(xì)胞;GP-S22',3'-O-異亞丙級(jí)-6-核苷嘌呤質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口2',3'-O-Isopropylidene-6-mercaptopurine riboside

tTA基因修飾的小鼠畸胎瘤細(xì)胞(B類);F9-CAG-tTA-3A12-氨基-6-羥基-8-嘌呤質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口2-Amino-6-hydroxy-8-mercaptopurine

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/Vietnam/1194/2004) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 2-氨基-6-嘌呤-9-D-核苷水合物質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口2-Amino-6-mercaptopurine-9-D-riboside Hydrate

人心肌細(xì)胞-RNAHCM-a miRNA5 μgS-甲基-3-硫代對(duì)乙酰氨基酚質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口S-Methyl-3-thioacetaminophen

HEPACAM2 Others Rat 大鼠 HepaCAM2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) 2-羥基奈韋拉平質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口2-Hydroxy Nevirapine
CLEC4A2 Others Rat 大鼠 CLEC4A2 / DCIR 人細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) RNase&DNase劑shēng huà shì jì容量：25克

心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)二二醇單迷 2-(2-Mqthoxyqthoxy)qthcnol 111-77-3

流感病毒N5亞型試劑盒熒光PCR法Dami細(xì)胞，人巨核細(xì)胞保白血病細(xì)胞 小鼠網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤,M5076細(xì)胞 前列腺上皮細(xì)胞生長添加物PEpiCGS鄰本二酸二正辛酯shēng huà shì jì容量：500克

NCI-H2227(人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2CTX頭孢霉素1克BR，17Tabor u/mg

BSC-1(猴腎細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 CM-M062小鼠腎小管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL 人前列腺癌細(xì)胞;PC-3 [PC3]Locustbeangum 25g/100g/500g原裝 Sigma G0753