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qPCR 實(shí)驗(yàn)Ct 值偏大或普通 PCR 產(chǎn)量低分析

日期:2024-10-31 06:18
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摘要: 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。 1、 RNA 模板質(zhì)量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。 2、 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來(lái)說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其zui 佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好)。 3、 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。 4、 基因本身原因(復(fù)雜和長(zhǎng)度),可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因...

逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。

1、 RNA 模板質(zhì)量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

2、 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來(lái)說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其zui 佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好)。

3、 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。

4、 基因本身原因(復(fù)雜和長(zhǎng)度),可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因的引物,避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)?;蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L(zhǎng)兩步法程序的延伸時(shí)間。

5、 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差,可以通過做平行不用品牌產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn),對(duì)比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。